Scientific Reports

Rezumat Etapa I

In etapa 1 (2020) a proiectului PERIOSILVERDDS s-au optimizat sistemele precursoare utilizate în prepararea biomaterialului compozit ca sistem de eliberare controlata a medicamentelor (DDS) din punct de vedere fizico-chimic. Sinteza nanoparticulelelor de argint (AgNps), unul din componentele materialului biocompozit, a fost optimizata din punct de vedere dimensional si morfologic prin urmarirea influentei parametrilor de sinteza (concentratia solutiilor apoase de azotat de argint si chitosan (CS), timpul de reactie, temperatura si masa moleculara a chitosanului) asupra marimii, formei si numarului de nanoparticule. Proprietatile optice investigate prin spectroscopie UV-Vis au demonstrat ca AgNps se formeaza in prezenta CS cu rol reducator si de stabilizare, iar parametrii optimi de sinteza au fost stabiliti ca [AgNO3]=70 mM, [chitosan]= 5 mg/mL, 18 ore, 90 oC si CS cu Mw=192.9 kDa. In urma analizei TEM, analizei de raze X si AAS s-au selectat 3 probe de AgNps obtinute in prezenta CS cu trei Mw diferite (52.9, 192.9 si 233.6 kDa) ca fiind relevante pentru analiza efectului citotoxic asupra celulelor epiteliale. Cele trei probe de CS-AgNps au aratat un efect cytotoxic dependent de concentratie (viabilitate celulara >80% pentru concentratii mai mici de 3.15 mg/mL AgNps) dar nu si de timpul de expunere. 

Optimizarea structurilor polimerice precursoare, 3D (criogeluri) sau 2D (filme/membrane), pe baza de CS si alcool polivinilic (PVA) s-a realizat cu scopul de a imbunatati performantele fizico-chimice ale produsului final dar si de a reduce toxicitatea. S-a luat in considerare inlocuirea reticulantului chimic folosit anterior (anhidrida glutarica, AG) sau a celui ionic (tripolifosfat de sodiu, TPP) cu alti agenti de reticulare. Astfel s-au realizat si comparat 4 variante de reticulare si anume:

1. Reticularea chimica fara adaugare de reticulant, prin intermediul reactiei de cuplare intre grupele complementare prezente/nou introduse pe cei 2 polimeri.

2. Reticularea fizica si chimica cu derivati diepoxidici

3. Reticularea fizica si ionica cu acizi dicarboxilici

4. Reticulare chimica cu AG si ionica prin folosirea unui nou reticulant ionic (sulfat de magneziu).

Proprietatile fizico-chimice ale materialelor sintetizate sunt influentate de continutul de CS, concentratia celor 2 polimeri, raportul dintre polimeri si dintre CS si agentul de reticulare, si de metoda de reticulare (chimica, fizica sau combinata). In general, cresterea continutului de CS a condus la o scadere a capacitatii de retinere a apei, la o crestere a rigiditatii si la o scadere a stabilitatii hidrolitice a hidrogelurilor.  Filmele cu mult PVA au proprietati mecanice bune insa introducerea CS intr-un raport de 50% fata de PVA confera proprietati mecanice acceptabile si grupe ionice necesare interactiei ulterioare cu medicamentul si cu AgNps. Folosirea tehnicii de inghet-dezghet pentru prepararea structurilor polimerice suport a introdus o reticulare suplimentara prin legaturi de hidrogen atat a PVA-lui, cat si a CS. S-au obtinut astfel, materiale cu proprietati mecanice si porozitate imbunatatite care pot fi ajustate prin alegerea judicioasa a conditiilor de preparare. Pentru fiecare varianta de preparare a structurilor polimerice s-au selectat parametrii optimi de preparare. Pentru 3 dintre variante s-au elaborat protocoalele de lucru (metodologia de preparare a hidrogelurilor) in vederea utilizarii in sinteza compozitelor.   

O lucrare stiintifica avand ca subiect sistemele de eliberare controlata mucoadezive pe baza de polizaharide pentru utilizarea in cavitatea bucala, a fost publicata. S-au elaborat 1 metoda de sinteza a AgNps acoperite cu chitosan si 3 metode de preparare a hidrogelurilor si filmelor pe baza de CS si PVA prin folosirea a trei metode diferite de reticulare.

Rezumat Etapa II

In Etapa 2 (2021) a proiectului PERIOSILVERDDS s-au optimizat sistemele precursoare utilizate in prepararea biomaterialului compozit ca sistem de eliberare controlata a medicamentelor (DDS) din punct de vedere biologic. S-a selectat procedeul de preparare și s-au optimizat parametrii de obținere a hidrogelurilor biocompozite ce conțin AgNps (H-AgNp) din punct de vedere structural și biologic. 

In acest scop au fost abordate câteva strategii de preparare și optimizare a condițiilor experimentale de obținere a unor biocompozite pe bază de chitosan (CS) și alcool polivinilic (PVA) sub formă de hidrogeluri/filme capabile de a incorpora nanoparticule metalice (argint (AgNps) și oxid de zinc (ZnONps)) și medicament antiinflamator (ibuprofen, IBF). 

1. Nanoparticulele de argint (AgNps) acoperite cu biopolimer (CS) (CS-AgNps), unul din componentele materialului biocompozit, sintetizate conform metodei descrise in Etapa 1/2020; activitatea 1.2. au fost testate  din punct de vedere al activitatii antimicrobiene pe bacterii reprezentative gram-pozitive (Staphylococcus aureus) și gram-negative (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae). S-au testat comparativ AgNps acoperite cu CS în formă protonată și neprotonată prin metoda difuziei pe agar și cea a diluțiilor de serie (pentru determinarea concentrației minim inhibitorii, CMI). Rezultatele experimentale au pus în evidență o activitate bactericidă puternică față de S. Aureus dar și față de K. Pneumoniae și P. aeruginosa. CMI a fost de 156 µg/ml pentru CS-AgNps protonate și de 5.4 µg/ml pentru cele în formă bazică, fapt datorat conținutului mai mare in Ag al celor din urmă. AgNps sintetizate în cadrul prezentului proiect pot fi utilizate la această concentrație in vitro, ele dovedindu-se citotoxice pentru o concentrație in argint mai mare de 3.1 mg/mL (Activitatea 1.1.2/2020-Testarea AgNps din punct de vedere al citotoxicității „in vitro”).
2. S-a stabilit metoda optimă de incorporare a medicamentului antiinflamator (ibuprofen, IBF) în materialele pe bază de CS și PVA (filme și hidrogeluri) și s-a studiat profilul de eliberare a IBF din matricile obținute într-un mediu care simulează saliva (mediu salivă artificială cu pH 6.8). Rezultatele au demonstrat că fiecare din cele 4 tipuri de materiale obținute prin tehnici diferite de reticulare a celor doi polimeri, prezintă capacitate de reținere a IBF și de eliberare a acestuia într-o manieră mult încetinită (24-48 ore) față de IBF liber. Suplimentar s-a sintetizat un hidrogel pe baza de polimer injectabil (Poloxamer 407-g-carboximetil pululan) și s-a verificat capacitatea acestuia de a încorpora și elibera ibuprofenul. Acest sistem a prezentat caracteristici de gelifiere și de eliberare interesante pentru tratamentul bolii paradontale țintită  în cadrul prezentului proiect.
3. S-a optimizat metoda de preparare a materialelor compozite, filme/hidrogeluri pe bază de CS și PVA cu AgNps sau nanoparticule de oxid de zinc (ZnONps), pentru fiecare din cele 4 variante de reticulare a celor 2 polimeri, din punct de vedere al dimensiunii și omogeneității distribuției acestora pe suprafața și în secțiunea materialelor. S-a stabilit metoda optimă de incorporare pentru fiecare material în parte iar biocompozitele obținute au fost optimizate (varierea concentrației de AgNO₃, raportul masic AgNps/polimeri) și caracterizate fizico-chimic (compoziție chimică, morfologie, grad de umflare și proprietăți mecanice și de bioadezivitate). In urma testelor de activitate antibacteriană și citotoxicitate s-a stabilit compoziția chimică optimă a fiecărui tip de biomaterial care va fi folosită în obținerea compozitelor cu AgNps sau ZnONps și ibuprofen in etapa finală a proiectului. Filmele compozite cu < 1% (g/g) AgNps, hidrogelurile reticulate cu diepoxizi încărcate cu 0.1% (g/g) AgNps mai mici de 100 nm și cele reticulate cu acid oxalic cu 0.6% (g/g) AgNps au prezentat, în același timp, o activitate antimicrobiană bună și o citotoxicitate acceptabilă. Toate cele 4 variante s-au dovedit adecvate pentru testarea ulterioară in prepararea materialului compozit cu AgNps și medicament antiinflamator. 
4. S-a elaborat 1 metodă de preparare a hidrogelurilor compozite pe bază de CS și PVA reticulate cu diepoxizi cu AgNps încorporate.

Rezumat Etapa III

In etapa 3/2022 a proiectului s-au preparat, optimizat și validat biomaterialele compozite pe bază de chitosan (CS) și alcool polivinilic (PVA) sub formă de hidrogeluri/filme conținând nanoparticule metalice (argint (AgNp)) și medicament antiinflamator (ibuprofen, IBF) ca sistem de eliberare susținută/controlată (DDS) în tratamentul local al paradontozei.  

• S-au preparat biomateriale compozite cu nanoparticule de argint (AgNp) și ibuprofen (IBF) plecând de la materialele compozite cu AgNp optimizate în etapa 2/2021. Fiecare dintre compozitele pe bază de CS și PVA au fost încărcate cu medicament și caracterizate fizico-chimic (structură și compoziție chimică, morfologie, grad de umflare în medii fiziologice simulate, precum și capacitatea de eliberare a medicamentului). S-a depus o cerere de brevet la OSIM pentru metoda de preparare a ME pe bază de CS și poli(vinil metil eter-co-acid maleic) (P) care a prezentat cel mai mare grad de noutate.
• S-a stabilit metoda optimă de preparare a biocompozitelor H-AgNp-D prin urmărirea influenței gradului de încărcare cu medicament (metoda de încorporare) asupra caracteristicilor fizico-chimice ale biomaterialelor finale obținute, precum și asupra proprietăților de biocompatibilitate ale acestora. S-a stabilit că materialele prezintă capacitatea de a încorpora cantități mari de IBF (9,67 mg/g ÷ 367 mg/g) însă citotoxicitatea nativă mare a IBF limitează cantitatea de IBF care poate fi incorporată la 300 mg/g. S-au elaborat 5 modele experimentale (ME) de filme (3) și hidrogeluri (2) pe bază de CS/PVA/AgNp-IBF cu potențial de utilizare ca sistem de eliberare a IBF in  tratamentul local al paradontozei.
• Din cele 5 ME s-a selectat 1 ME de biomaterial tip hidrogel pe bază de CS/PVA reticulat cu acid oxalic și încărcat cu AgNp și IBF in vederea validării. Selecția biomaterialului compozit s-a realizat prin analiza critică a proprietăților și caracteristicilor fiecărui ME elaborat anterior. ME selectat este un hidrogel obținut prin reticularea ionică și fizică a celor două componente polimerice cu acid oxalic, încărcat cu 0,225% (procente masice) AgNp acoperite și stabilizate de CS (care compatibilizează cele trei componente PVA-CS-AgNp ale sistemului prin interacțiuni de hidrogen) și cu 30% (procente masice) medicament.
• Proprietățile biologice in vitro ale ME biomaterial compozit PVA/CS/OA-AgNp-IBF au fost testate stabilindu-se cinetica de eliberare a IBF în medii ce simulează saliva (saliva artificială cu pH=6,8), activitatea antibacteriană față de bacterii reprezentative pentru infecțiile gingivale și paradontoză, precum și biocompatibilitatea. ME indeplinește cerințele unui sistem de eliberare susținută a IBF (capacitate de eliberare a IBF într-o manieră incetinită pe parcursul a 24 ore prin comparație cu medicamentul liber), fiind biocompatibil în contact direct cu celulele fibroblaste adulte și asigurând o activitate antibacteriană semnificativă față de bacteriile gram-pozitive dar și gram-negative aerobe (P. aeruginosa, K. pneumoniae) sau anaerobe (P. gingivalis). Testele in vivo au pus in evidență efectul ne-iritant al acestui biomaterial după 72 ore.
• S-au efectuat teste de reproductibilitate prin realizarea unor șarje diferite de ME care au fost caracterizate fizico-chimic demonstrându-se că metoda de preparare a ME este fezabilă, valorile obținute pentru randament, conținutul în AgNp și IBF nediferind sennificativ între șarje, diferențele încadrându-se în limita erorilor acceptate. Pentru ME selectat s-a elaborat tehnologia de laborator avizată de Comisia de avizare a rezultatelor și lucrărilor științifice din instituția coordonatoare de proiect (ICMPP) cu nr. 3536 /06.07.2022. Mai mult, ME a fost testat in vivo și s-a dovedit efectul său antiinflamator și cicatrizant (indus de prezența AgNp). Toate aceste studii au validat ME pentru utilizarea ca DDS în tratamentul local al paradontozei.

Publications

2020

1. Mucoadhesive buccal drug delivery systems containing polysaccharides, I.M. Pelin, D.M. Suflet, Cellulose Chemistry and Technology 54 (9-10), 889-908  (2020). https://doi.org/10.35812/CelluloseChemTechnol.2020.54.86 (Q3, FI=1.467)

2021

1. Smart Nanomaterials for Biomedical Applications—A Review, M. Aflori, Nanomaterials 11(2), 396 (2021). https://doi.org/10.3390/nano11020396 (Q1, FI= 5.076)
2. Dual Cross-Linked Chitosan/PVA Hydrogels Containing Silver Nanoparticles with Antimicrobial Properties,  D.M Suflet, I. Popescu, I.M Pelin, D.L Ichim, O.M Daraba, M. Constantin, G. Fundueanu,  Pharmaceutics 13 (9), 1461 (2021). https://doi.org/10.3390/pharmaceutics13091461 (Q1, FI= 6.321)
3. Thermosensitive Poloxamer-graft-Carboxymethyl Pullulan: A Potential Injectable Hydrogel for Drug Delivery, M. Constantin, B. Cosman, M. Bercea, G.L. Ailiesei, G. Fundueanu, Polymers 13(18), 3025 (2021). https://doi.org/10.3390/polym13183025 (Q1, FI=4.329)
4. Biocomposite hydrogels for the treatment of bacterial infections: Physico-chemical characterization and in vitro assessment, D.M. Rata, A.N. Cadinoiu, M. Popa, L.I. Atanase, O.M. Daraba, I. Popescu, L.E. Romila, D.L. Ichim, Pharmaceutics 13, 2079 (2021). https://doi.org/10.3390/pharmaceutics13122079 (Q1, FI = 6.321)
5. Chitosan-PVA composite hydrogels: synthesis, characterization and their antibacterial properties, B. Cosman, D.M. Rata, D.M. Suflet, G. Fundueanu; Proceedings of the Progress in Organic and Macromolecular Compounds Conference, ISSN 2810 – 2347 ISSN – L 2810 – 2126, pg. 127-128 (2021).

2022

1. Eco-friendly Synthesized PVA/Chitosan/Oxalic Acid Nanocomposite Hydrogels Embedding Silver Nanoparticles as Antibacterial Materials, I. Popescu, M. Constantin, I.M. Pelin, D.M. Suflet, D.L. Ichim, O.M. Daraba, G. Fundueanu, Gels 8(5), 268 (2022). https://doi.org/10.3390/gels8050268 (Q1, FI=4,702)
2. Silver nanoparticles biocomposite films with antimicrobial activity: in vitro and in vivo tests, A.N. Cadinoiu, D.M. Rata, O.M. Daraba, D.L. Ichim, I. Popescu, C. Solcan, G. Solcan, International Journal of Molecular Sciences ( Q1, FI=5,542, in evaluare).

Patents

1. Procedeu de obținere a unui film compozit pe bază de chitosan, poli(metil vinil eter-alt-acid maleic) și nanoparticule de argint cu activitate antimicrobiană, S.M. Bucatariu, D.M. Suflet, M. Fundueanu-Constantin, B.P. Cosman, I. Popescu, I.M. Pelin, G. Fundueanu-Constantin, cerere de brevet A/00218 (28.04.2022)

Conferences

1.    Design of chitosan films via solvent free thermal cross linking method; S. Bucatariu, B. Cosman, G. Fundueanu, M. Constantin; International Congress of the „Apollonia” University from Iasi „By promoting excellence, we prepare the future” XXXIth Edition, Iasi, Romania, 01-03.03. 2021 (comunicare orala)

2.    Chitosan/oxalic acid/poly(vinyl alcohol) cryogels for biomedical applications; I.M. Pelin, I. Popescu, M. Constantin; International Congress of the „Apollonia” University from Iasi „By promoting excellence, we prepare the future” XXXIth Edition, Iasi, Romania, 01-03.03. 2021 (comunicare orala)

3.    Chitosan-based hydrogel loaded with anti-inflammatory drug for local treatment of periodontitis; A.N. Cadinoiu,  L.I. Atanase, I. Popescu, D.M. Rata; International Congress of the „Apollonia” University from Iasi „By promoting excellence, we prepare the future” XXXIth Edition, Iasi, Romania, 01-03.03. 2021 (comunicare orala)

4.    Chitosan-PVA composite hydrogels: synthesis, characterization and their antibacterial properties; B. Cosman, D.M. Rata, D.M. Suflet, G. Fundueanu; Progress in Organic and Macromolecular Compounds Conference, MacroIasi'2021, Iasi, Romania, 7-9.10. 2021 (poster)

5.    Double crosslinked chitosan/poly(vinyl alcohol) based hydrogels for the treatment of inflammatory diseases; A.N. Cadinoiu, L.I. Atanase, L. Romila, I. Popescu, M. Popa, D.M. Rata; 9th International Congress & Expo on Biotechnology & Biomaterials, Venetia, Italia, september 23-25, 2021 (poster)

6.    ZnO nanoparticles immobilized in hydrogels-in vitro antibacterial activity and cytotoxicity tests; D.M. Rata, A.N. Cadinoiu, L.I. Atanase, O.M. Daraba, D.L. Ichim; 9th International Congress & Expo on Biotechnology & Biomaterials, Venetia, Italia, september 23-25, 2021 (poster)

7.    Chitosan-PVA films containing silver nanoparticles for periodontitis treatment; M. Constantin, M. Lupei, S. Bucatariu, I.M. Pelin, G. Fundueanu, D.L. Ichim, O.M. Daraba; 32nd Edition of the International Congress of Apollonia University “Preparing the future by promoting excellence”, Iasi, Romania, 28.02-1.03.2022 (comunicare orala)

8.    Preparation and characterization of CS/PVA hydrogels containing in situ generated silver nanoparticles; D.M. Suflet, M. Fundueanu-Constantin, D.M. Rata; 32nd Edition of the International Congress of Apollonia University “Preparing the future by promoting excellence”, Iasi, Romania, 28.02-1.03.2022 (comunicare orala)

9.    Physicochemical characterization and evaluation of antimicrobial activity of silver nanoparticles encapsulated into chitosan/PVA hydrogels; I. Popescu, M. Constantin, I.M. Pelin, D.L. Ichim, O.M. Daraba; 32nd Edition of the International Congress of Apollonia University “Preparing the future by promoting excellence”, Iasi, Romania, 28.02-1.03.2022 (comunicare orala)

10.    Activitatea antimicrobiană a unor hidrogeluri compozite inovative cu posibile aplicații in tratamentul parodontozei;  D.L. Ichim, A.N. Cadinoiu, L.I. Atanase, D.M. Rata;  32nd Edition of the International Congress of Apollonia University “Preparing the future by promoting excellence”, Iasi, Romania, 28.02-1.03.2022 (poster)

11.    Evaluarea citotoxicitatii unor hidrogeluri biocompozite pe baza de chitosan cu aplicatii in medicina; O.M. Daraba, D.M. Rata, A.N. Cadinoiu, L.I. Atanase; 32nd Edition of the International Congress of Apollonia University “Preparing the future by promoting excellence”, Iasi, Romania, 28.02-1.03.2022 (poster)

12. Composite hydrogels based on chitosan and PVA with potential applications in the treatment of periodontitis; I. Popescu, M. Constantin, A.L. Vasilache, D.M. Rata, L.I. Atanase; The 49th Word Polymer Congress IUPAC-MACRO 2022, Winnipeg, Canada, 17-21.07.2022 (poster)