Proiect bilateral Romania-Franta 315/14.05.2009

Sinteza si caracterizarea de nanoparticule magnetice PEG-magnetita

Parteneri :
- Institutul de Chimie Macromoleculara « Petru Poni »
- Centre de Mise en Forme des Materiaux (CEMEF), Mines ParisTech Sophia-Antipolis, France

CUPRINS

Obiectiv general: Sinteza si caracterizarea de nanoparticule magnetice PEG-
                          magnetita

Obiectivele fazei I de executie (2009):

•        Sinteza particulelor de magnetita cu dimensiuni nanometrice
•        Caracterizarea sub aspect dimensional si al proprietatilor magnetice
•  Caracterizarea particulelor (AFM, SEM, determinarea proprietatilor magnetice si reologice)
•        Acoperirea particulelor de magnetita cu 3-aminopropiltrietoxisilan

(APTES)

Obiectivele fazei II de executie (2010)

grupari carboxilice (PDMSg-PEG-COOH). Caracterizare structurala.

REZUMAT

Proiectul continua colaborarea de peste 10 cu colectivul din Franta. Impreuna cu acest colectiv s-au publicat peste 10 articole in reviste cotate ISI (ex. Macromolecules, Polymer, High Performance Polymers, etc) si au fost efectuate peste 10 stagii de cercetare de membrii colectivului roman in laboratorul francez si peste 5 stagii de catre colectivul francez in laboratorul din Romania.
In cadrul prezentului proiect principalul obiectiv a fost de a sintetiza si a analiza proprietatile unor particule magnetice acoperite  pentru aplicatii biomedicale. In particular, au fost preparate nano-particule magnetice cu dimensiuni controlate de tip magnetita/siloxan-polietilenglicol si magnetita/acid oleic  hidrofobe (se obtin suspensii stabile in solventi hidrofobi) si nano-particule magnetita/siloxan polietilenglicol, magnetita/acid oleic si magnetita/ aminopropiltrietoxisilanhidrofile (se obtin suspensii stabile in apa).
Particulele acoperite au fost caracterizate prin spectroscopie FT-IR, miscroscopie de forta atomica de baleiaj (SEM) si de de transmie (TEM) si prin analize dimensionale (Coulter® Nano-sizer). De asemenea, au fost determinate proprietatile magnetice si reologice ale acestora.
Ultima parte a studiului, care este in progres, s-a axat pe studiile reologice si electro-reologice ale suspensiilor stabile in apa de particule magnetice in prezenta de ADN si poliamidoetil fosfit pentru a determina interactiunea particula magnetica acoperita cu PEG si grupari carboxilice cu ADN pentru stalilirea mecanismului de obtinere a bioconjugatelor. In acest studiu s-a considerat ca model conjugatele magnetita/aminopropiltrietoxisilan si magnetita-acid oleic cunoscute in literatura.
Particulele magnetice hidrofile prezinta interes in aplicatiile biomedicale, cum ar fi imagistica RMN, iar cand sunt purtatoare de principiu activ sunt utilizate in tratarea unor tumori canceroase.
Faza de executie I a urmarit sinteza particulelor magnetice cu grupari hidroxilice (HO-)  prin coprecipitarea ionilor Fe2+ si Fe3+ prin metoda Massart. Particulele magnetice obtinute au fost caracterziate sub aspect dimensional prin microscopie de forta atomica (AFM), microscopie electronica de baleiaj (SEM) si analiza dimensionala a particulelor (Microtrac-nanotrac analyzer 250). Proprietatile magnetice au fost studiate cu ajutorul unui magnetometru cu proba vibranta (Lake Shore 7410).
Particulele de magnetita-monomer silanic cu grupari aminice terminale au fost sintetizate prin condensarea gruparilor HO- cu gruparile etoxisilanice din  3-aminopropiltrietoxisilan (APTES) prin refluxarea particulelor de magnetita neacoperite dispersate in dicloretan in prezenta de APTES si dibutil-staniu-dilaureat cu rol de catalizator de condensare.
Particulele magnetice magnetita/APTES realizeaza suspensii coloidale stabile in apa.
In a II-a etapa a proiectului au fost preparate suspensii coloidale magnetice in urmatoarele etape:
Sinteza copolimerului amfifil polidimetilsiloxan grefat cu poli(etilen oxid) cu grupari terminale carboxilice (PDMSgPEG-COOH). Caracterizare structurala si comportare in medii hidrofobe si hidrofile.

Publicatii:

Buget:

Rezultate si discutii

Autoasamblarea copolimerilor amfifili, care contin in structura lor secvente hidrofobe sau hidrofile, prezinta un interes crescut datorita posibilitatii controlului proprietatilor solutiei lor si investigarii in detaliu a fortelor, care determina agregarea2-7. Astfel de compusi macromoleculari pot fi utilizati in calitate de compusi model pentru determinarea unui anumit comportament specific al sistemelor biologice complexe. Astfel este descrisa in literatura posibilitatea utilizarii copolimerilor amfifili in procesul de acoperire al unor anumite particule si ca sisteme transportoare de medicamente. Copolimerii amfifili introdusi intr-un solvent selectiv pentru una sau doua secvente, se autoasambleaza in agregate de micele, care contin un miez constituit dintr-o secventa insolubila inconjurat de o secventa solubila stil coroana2. Intr-un amestec de solventi polari/nepolari secventele hidrofile sau hidrofobe ale copolimerilor amfifili se directioneaza catre solventul polar, respectiv nepolar. Acest comportament tipic specific este deosebit de interesant, deoarece separarea de faza este importanta in design-ul nano-obiectelor si nanoparticulelelor de diferite forme8. Recent s-a studiat sinteza reactoarelor moleculare active pe baza de poliorganosiloxani amfifili utilizati in obtinerea de coloizi pe baza de Zn2+ si de aur9-11. Incompatibilitatea pronuntata datorita hidrofobicitatii polidimetilsiloxanului (PDMS) cu marea majoritate a polimerilor organici este balansata de prezenta unitatilor solubile de PEG, copolimerii dibloc PDMS-poli(etilen oxid) (PEG) sunt puternic amfifili si se autoasambleaza in solutie cu formarea unor morfologii diferite in functie de natura solventului, gradul de polimerizare si de proportia intre secventele hidrofobe si hidrofile2.
Aceste materiale prezinta aplicatii tehnologice importante; copolimerii dibloc amfifili care contin grupe carboxilice se utilizeaza la obtinerea de nanofluide magnetice stabilizate steric12. Acesti copolimeri bloc PDMS-PEG actioneaza ca surfactanti de stabilizare pentru particulele de magnetita datorita capacitatii gruparilor carboxilice de a interactiona prin legaturi de hidrogen cu gruparile hidroxilice de pe suprafata particulelor de magnetita12,13.
Pana in prezent, in literatura de specialitate a fost descrisa sinteza, caracterizarea copolimerului amfifil grefat siloxan/α-carboxiester-poli(etillen oxid) si micelizarea atat in solutie apoasa cat si in solutie de toluen1,14. S-a studiat de asemenea formarea microparticulelor de magnetita de tip „core-shell” stabilizate cu copolimerul grefat siloxan/α-carboxiester-poli(etillen oxid)15,16.

Sinteza  polidimetilsiloxaului grefat cu PEG w- functionalizat cu grupari carboxilice

Copolimerul poli[dimetilsiloxan-g-(carboxiester-polietilenglicol)] (PDMSgPEG-COOH) a fost obtinut in mai multe etape conform schemei 1. Caracteristicile prepolimerilor si a copolimerilor finali sunt ilustrate in tabelul 1.
Structura copolimerului PDMSgPEG-COOH a fost pusa in evidenta prin 1H-RMN (Fig. 1.), iar randamentul mic de reactie (65%) este datorat reactiilor secundare posibile (descompunerea gruparilor COOH si reticularea) precum si procedurii laborioase de purificare a produsului. Rezultate similare au fost observate si pentru alti copolimeri amfifili pe baza de PEG, care pot fi explicate prin posibila absorbtie a segmentelor de PEG in materialul coloanelor analitice17.
Utilizarea copolimerilor bloc amfifili in sinteza de nanoparticule ofera avantajul proprietatilor de autoasamblare. Dupa cum sugereaza si numele, copolimerii bloc amfifili contin atat segmente hidrofobe cat si hidrofile. Acest caracter dualist le confera aplicatii practice interesante. De exemplu, autoasamblarea polimerilor este in mare masura demonstrata in sisteme biologice, in cazul plierii proteinelor in elice sau foaie de ziar si agregate pentru structuri asemanatoare ribozomilor18.

Sinteza particulelor de magnetita cu dimensiuni nanometrice; Caracterizarea sub aspect dimensional si al proprietatilor magnetice; Caracterizarea particulelor (AFM, SEM, determinarea proprietatilor magnetice si reologice); Acoperirea particulelor de magnetita cu 3-aminopropiltrietoxisilan (Fig. 2)     
Sinteza particulelor magnetice cu grupari hidroxilice (HO-) s-a realizat prin coprecipitarea ionilor Fe2+ si Fe3+ prin metoda Massart. Particulele magnetice obtinute au fost caracterziate sub aspect dimensional prin microscopie de forta atomica (AFM), microscopie electronica de baleiaj (SEM) si analiza dimensionala a particulelor (Microtrac-nanotrac analyzer 250). Proprietatile magnetice au fost studiate cu ajutorul unui magnetometru cu proba vibranta (Lake Shore 7410) (Fig. 2.).
Particulele de magnetita-monomer silanic cu grupari aminice terminale (Fig. 2) au fost sintetizate prin condensarea gruparilor HO- de pe suprafata particulelor de magnetita cu gruparile etoxisilanice din  3-aminopropiltrietoxisilan (APTES) prin refluxarea particulelor de magnetita neacoperite dispersate in dicloretan in prezenta de APTES si dibutil-staniu-dilaureat, cu rol de catalizator de condensare. Schema de reactie si caracterizarea particulelor magnetice magnetita/APTES sunt prezentate in Figura 1.
Particulele magnetice magnetita/APTES realizeaza suspensii coloidale stabile in apa.

Suspensii coloidale stabile in apa pe baza de magnetita- PDMSgPEG-COOH (schema 2) au fost obtinute in doua etape:

Particulele de magnetita acoperite au fost obtinute prin coprecipitarea solutiilor apoase de FeCl3 x 6H2O si FeCl2 x 4H2O. Aceste solutii au fost agitate mecanic continuu sub atmosfera de azot, dupa care s-a adaugat apoi o solutie de hidroxid de amoniu (25%) pana la pH 9–10. S-a format un precipitat de culoare neagra de particule magnetice. In etapa urmatoare, peste dispersia apoasa de magnetita s-a adaugat o solutie de PDMSg-PEG-COOH  in diclormetan. Dupa o ora s-a adaugat solutie apoasa de HCl in picatura pana la pH acid (pH ~ 3).
Particulele hidrofobe de Ma/PDMSg-PEG-COOH au fost separate din emulsie prin evaporarea diclormetanului la rotaevaporator sub vid, apoi au fost suspendate in toluen pentru indepartarea siloxanului nereactionat. Particulele de culoare neagra de Ma/PDMSg-PEG-COOH au fost filtrate, spalate cu apa si acetona si uscate apoi la 60oC.
Particulele hidrofobe Ma/PDMSg-PEG-COOH au fost caracterizate prin spectroscopie FTIR (Figura 2), miscroscopie de forta atomica (Figura 3), SEM-EDX. (Figura 4) si s-au determinat proprietatile magnetice (Figura 5). Particulele sunt de forma sferica, prezinta o distributie uniforma a metalului, au dimensiuni cuprinse intre 50-60 nm si prezinta proprietati magnetice in concordanta cu cele din literatura1,19.

Obtinerea suspensiilor stabile in apa pe baza departicule de magnetita- PDMSgPEG-COOH.
La particulele magnetice Ma-PDMSgPEG-COOH s-au adaugat un al doilea strat de PDMSgPEG-COOH in amestec de solventi apa/toluen prin intermediul interactiunile hidrofobe intre lanturile polidimetilsiloxanice, lanturile hidrofile PEG-COOH de la al doilea strat sunt dispuse in exteriorul particulelor.

Obtinerea suspensiilor stabile in apa pe baza particule magnetita-acid oleic
Sinteza s-a realizat in doua etape:

Studii reologice si electro-reologice  ale particulelor solubile in apa in prezenta de ADN si poliamidofosfit.

S-au realizat studii reologice si reo-electrice ale suspensiilor coloidale stabile in apa (magnetita- PDMSgPEG-COOH si magnetita-acid oleic) in diferite concentratii in prezenta de ADN si poliamidofosfit. Studiile arata ca particulele acoperite se conjuga cu polimerii mentionati, obtinandu-se suspensii de conjugate particula magnetica-ADN sau particula magnetica – poliamidofosfit. Mecanismul de complexare va fi pus la punct pana la sfarsitul anului 2010 impreuna cu partenerul francez.

Concluzii
- S-au sintetizat particule de magnetita prin metoda Massart cu un randament ridicat, dimensiunea medie a particulelor este de 253 nm iar polidispersitatea dimensionala de 1.6-1.7; forma sferica a particulelor de magnetita a fost pusa in evidenta prin microscopie de forta atomica (AFM) si microscopie de baleiaj (SEM); valoarea de magnetizatie de 64 emu/g este apropiata de valorile raportate in literatura; s-au obtinut particule de magnetita acoperite cu TMSPA (sau APTES), legarea covalenta a monomerului silanic fiind confirmata prin analize FT-IR si ATG.
- S-a realizat sinteza si comportamentul copolimerului amfifil polidimetilsiloxan grefat cu poli(etilen oxid) cu grupari terminale carboxilice (PDMSgPEG-COOH) in apa.
Copolimerul a fost sintetizat printr-o metoda de sinteza, care cuprinde mai multe etape intermediare. Masuratorile de tensiune superficiala si de fluorescenta arata ca are loc micelizarea copolimerului grefat atat in mediu apos cat si in mediu organic. In forma neionizata, in solutii apoase la pH=4 copolimerul prezinta trei etape de agregare si anume, micelizare cu un singur lant la concentratii de pana la CMC1=1,01 g/L, micelizare intre lanturile polimerice in intervalul dintre cele doua concentratii CMC1 si CMC2=1,73 g/L urmata de agregarea intre micele alaturi de formarea unui gel la concentrati mai mari. Dimensiunile micelelor creste cu cresterea concentratiei solutiei de la 18 la 46 nm, valori care corespund agregarii intr-un singur lant sau in mai multe lanturi.
In forma ionizata, in solutii apoase de copolimer (pH=8) din studiile de fluorescenta se obtine doar o valoare de CMC=5,25 g/L marcand tranzitia dintre micelizarea intr-un singur lant cu miez siloxanic si invelis extins de PEG-COOH si asocierilor intre lanturile polimerice formate in ciuda prezentei gruparilor carboxilice disociate. Ambele agregate micelare au forme de bagheta/fir (conuri scurte).    
Formarea particulelor magnetita/ PDMSgPEG-COOH in urma interactiunilor gruparilor –COOH cu lantul PEG in solutia de toluen a copolimerului hidrofob-hidrofil PDMSgPEG-COOH a fost demonstrata prin FT-IR. Imaginile AFM ale particulelor de magnetita acoperite cu PDMSgPEG-COOH prezinta o morfologie de tip „core-shell” cu o forma aproximativ sferica a particulelor si un diametru mediu de 300 nm. Din analizele EDX se poate observa distributia uniforma a elementelor din compozitia particulelor Ma-PDMSgPEG-COOH.
Studiile reologice preliminarii demonstreaza formarea bioconjugatelor particula magnetica acoperita-biopolimer.

Publicatii:

Participari la manifestari stiintifice internationale:
- A. Durdureanu-Angheluta,  L. Pricop, M. Pinteala, V. Harabagiu, B. C. Simionescu, PARTICULE MAGNETIQUES “CORE-SHELL“ OBTENU PAR POLYSILOXANES GREFFE AVEC CARBOXYLIQUES GROUPS, IXème Colloque Franco - Roumain sur les Polymères SYNTHESE ET PROPRIETES DES POLYMERES; LES POLYMERES ET L’ENVIRONNEMENT, Alba Iulia, Roumanie 27 – 29 Août 2009.
- Anamaria Durdureanu-Angheluta, Lucia Pricop, Mariana Pinteala, Radu Tigoianu, Iuliana Stoica, Andrei Dascalu, Valeria Harabagiu, Bogdan C. Simionescu, Micellization in amphiphilic siloxane/α-carboxyester-poly(ethylene oxide) graft copolymers solutions. Applications, Frontiers in Macromolecular and Supramolecular Science Second Cristofor I. Simionescu Symposium, Iasi, Romania, 02-03.06.2009
Buget:

Schema 1. Sinteza copolimerului poli{dimetilsiloxan-g-[carboxiester-poli(etilen oxid)]} (PDMSgPEG-COOH).

Tabel 1.Caracteristicile precursorilor si copolimerului pe baza de polidimetilsiloxan

a calculat din integralele caracteristice protonilor din spectrul 1H-RMN; b din GPC; c1 calculat din procentul de H si din Mn ale H-PDMS; c2 100x = 5890. 0.0529 + .1150x, unde x este numarul de mol Si-H/mol H-PDMS; c3 100x = 15040.0.048 + 100.04x, unde x este numarul de mol Si-PEG-OH/PDMSgPEG-OH mol; d calculat; e calculat folosind Mn al H-PDMS;
f determinat dupa Nicholas20; g calculat folosind continutul de grupari HO, Mn a precursorilor H-PDMS si A-PEG-TS; h calculat folosind continutul de grupari HO, Mn a precursorilor H-PDMS si A-PEG-TS; i calculat folosind Mn experimental pentru copolimerul PDMSgPEG-OH; j determinat prin titrare potentiometrica; k calculat folosind Mn experimental pentru copolimerul PDMSgPEG-OH si calculata din continutul in grupari COOH; l calculat folosind Mn experimental pentru copolimerul PDMSgPEG-OH si din continutul in grupari COOH experimental.

Fig. 2. Spectrul 1H-RMN al copolimerului PDMSg-PEG-COOH

Schema 2. Procesul de invelire a particulelor de magnetita cu un ssingur strat de  PDMSg-PEG-COOH si cu dublu strat de PDMSgPEG-COOH

Bibliografie
1. L.Pricop, A.Durdureanu-Angheluta, M.Pinteala, M.Spulber, A.Fifere, N.L.Marangoci, A.I.Dascalu, R.Tigoianu, V.Harabagiu, B.C.Simionescu « Synthesis and micellization of polydimethylsiloxane – carboxy-terminated poly(ethylene oxide) graft copolymer in aqueous and organic media »,  e-Polymers  no. 093 (2010).
2. Riess, G. Progr. Polym. Sci. 2003, 28, 1107.
3. Astafieva, I.; Khougaz, K.; Eisenberg, A. Macromolecules 1995, 28, 7127.
4. Lysenko, E.A.; Bronich, T.K.; Slonkina, E.V.; Eisenberg, A.; Kabanov, V.A.; Kabanov, A.V. Macromolecules 2002, 35, 6351.
5. Schadler, V.; Kniese, V.; Thurn-Albrecht, T.; Wiesner, U.; Spiess, H.W. Macromolecules 1998, 31, 4828.
6. Jain, S.; Bates, F.S. Science 2003, 300, 460.
7. Discher, D.E.; Eisenberg, A. Science 2002, 297, 964.
8. Shandryuk, G.A.; Matukhina, E.V.; Vasil’ev, R.B.; Rebrov, A.; Bondarenko, G.N.; Merekalov, A.S.; Gas’kov, A.M.; Talroze, R.V. Macromolecules 2008, 41, 2178.
9. Voronov, A.; Kohut, A.; Peukert, W. Langmuir 2007, 23, 360. 
10. Jungmann, N.; Schmidt, M.; Maskos, M. Macromolecules 2003, 36, 3974
11. Racles, C.; Cazacu, M.; Ioanid, A.; Vlad, A. Macromol. Rapid Commun. 2008, 29, 1527.
12. Moeser, G.D.; Green, W.H.; Laibinis, P.E.; Linse, P,.;Hatton, T.A. Langmuir 2004, 20, 5223.
13. Wilson, K.S.; Harris, L.A.; Goff, J.D.; Riffle, J.S.; Dailey, J.P. European Cell and Materials 2002, 3, 206.
14. Anamaria Durdureanu-Angheluta, Lucia Pricop, Mariana Pinteala, Radu Tigoianu, Iuliana Stoica, Andrei Dascalu, Valeria Harabagiu, Bogdan C. Simionescu, Micellization in amphiphilic siloxane/α-carboxyester-poly(ethylene oxide) graft copolymers solutions. Applications, Frontiers in Macromolecular and Supramolecular Science Second Cristofor I. Simionescu Symposium, Iasi, Romania, 02-03.06.2009
15. A.Durdureanu-Angheluta, M. Pinteala, L. Pricop, I. Stoica, V. Harabagiu, B.C. Simionescu, “Magnetite particles functionalized with an COOH-siloxane”, ESF-UB Conference in Biomedicine Nanomedicine 2008, San Feliu de Guixols, Spania, 19-24 septembrie 2008.
16. A. Durdureanu-Angheluta,  L. Pricop, M. Pinteala, V. Harabagiu, B. C. Simionescu, PARTICULE MAGNETIQUES “CORE-SHELL“ OBTENU PAR POLYSILOXANES GREFFE AVEC CARBOXYLIQUES GROUPS, IXème Colloque Franco - Roumain sur les Polymères SYNTHESE ET PROPRIETES DES POLYMERES; LES POLYMERES ET L’ENVIRONNEMENT, Alba Iulia, Roumanie 27 – 29 Août 2009.
17. (a) Creutz, S.; Teyssie, P.; Jerome, R. Macromolecules 1997, 30, 6; (b) Bines, F.L.; Billingham, N.C.; Armes, S.P. Macromolecules 1996, 29, 3416.
18. Whitesides, G. M.; Mathias, J. P.; Seto, C. T., Science, 1991, 254, 1312
19. A. Durdureanu-Angheluta, L.Pricop, I.Stoica, C.-A. Peptu, A.I.Dascalu, N. Marangoci, M.Spulber, M.Pinteala, B.C. Simionescu, « Silicon magnetic fluids based on magnetite particles covered with α-trietoxysilil- polydimethylsiloxane », Journal of Magnetism and Magnetic Materials 322, 2956–2968 (2010)  
20. Nicholas, D.; Cherons, T. Organic Functional Group Analysis by Micro and Simimicro Methods, Ed. John Willes & Sons, INC, New York, London, Sidney, 1964, pp.493-494.